迎接蛋白組學(xué)樣品處理新挑戰 Empore StageTips助力高通量檢測

蛋白組學(xué)的實(shí)驗過(guò)程高度依賴(lài)優(yōu)化的樣品前處理。其中，蛋白消解和質(zhì)譜分析這兩步之間的處理過(guò)程對整體分析質(zhì)量和靈敏度有著(zhù)非常重要的影響。一種名為StageTips的關(guān)鍵技術(shù)于2003年由南丹麥大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域著(zhù)名學(xué)者Matthias Mann報道，并因其高效和簡(jiǎn)便而在蛋白組學(xué)研究中得到廣泛使用。許多研究機構根據自身課題特點(diǎn)開(kāi)發(fā)了StageTips的應用規程。

StageTips是一種填充了Empore膜片的微量移液管。其全稱(chēng)是“Stop and go extraction tips”，喻意為蛋白分解產(chǎn)生的肽被Empore膜片攔截，然后由適當的溶劑釋放出來(lái)。這個(gè)過(guò)程中，鹽份去除，肽得到純化和濃縮，或者預分餾。Empore膜片由高分子纖維網(wǎng)固定住的功能顆粒構成，同時(shí)具有很好的物理特性（如柔軟、致密）和化學(xué)特性（如高保留因子），使StageTips特別適用于LC/MS分析之前處理肽溶液樣品。膜片中功能顆粒種類(lèi)的多樣性使StageTips具有多種不同性能，可以根據應用內容有多種選擇，并可以在一支StageTips中組合使用。

a - 單層Empore膜片的StageTips（放大圖中為Empore膜片材料結構示意）; b – 多層膜片的StageTips ；

圖1 StageTips外觀(guān)

Empore相對于用松散顆粒制成的產(chǎn)品有多種優(yōu)勢，包括：顆粒填充致密無(wú)溝流；無(wú)需篩板；洗脫體積??；容量可由增加膜片層數而擴大。

圖2.  Empore StageTips 質(zhì)量控制：這些數據顯示SDB-RPS StageTips 在不同批次和同一批次內測試結果的良好可重復性和可靠性，證實(shí)生產(chǎn)工藝的*性。

應用實(shí)例一：美國著(zhù)名醫院Mayo Clinic 于2020 開(kāi)發(fā)了基于StageTips和臨床質(zhì)譜的 疫情快速診斷方案，可以達到和PCR相似的精度。

圖3. Mayo Clinics疫情高通量檢測方案：基于StageTips 和OrbiTrap LC-MS。

應用實(shí)例二：高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

DNA轉錄成mRNA要再翻譯成具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)才能在體內發(fā)揮功能，其中大部分蛋白質(zhì)往往還需要經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾才能具備真正的活性，這種修飾稱(chēng)為翻譯后修飾（PTM）。翻譯修飾的過(guò)程，就是在蛋白質(zhì)氨基酸序列中添加特定氨基酸或改變特定化學(xué)官能團的過(guò)程，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結構。已有實(shí)驗證明有三百多種潛在的PTM類(lèi)型，并且同一個(gè)蛋白質(zhì)可能在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生修飾，這就促成了蛋白結構和功能上的多樣性。在眾多的PTM類(lèi)型中，磷酸化修飾（Phosphorylation modification）的蛋白占到了所有蛋白質(zhì)約三分之一，是普遍的修飾類(lèi)型之一。會(huì )影響到細胞內信號轉導、細胞結構、細胞增殖、凋亡、轉錄、代謝過(guò)程以及調控病原微生物的適應能力等等，所以在不同細胞中，蛋白磷酸化水平會(huì )呈現不同的差異，特定位點(diǎn)的磷酸化程度可能從小于1%到大于90%。

圖 4. StageTips 用于高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是研究這個(gè)蛋白質(zhì)磷酸化修飾的重要方法之一。如圖四所示，通過(guò)采用基于StageTips的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備方法，相對于傳統樣品制備方法來(lái)說(shuō)，所需要的檢測樣品少了10倍，檢測時(shí)間減少3倍，但定量化磷酸化位點(diǎn)增加了3倍，極大了提高了研究效率。

高堿性條件下的分餾可大大提高蛋白質(zhì)檢出率。相比于傳統的方法，比如離線(xiàn)HPLC 泵，或者散裝填料裝的Tips，Empore C18 Stage Tips 更為高效，同時(shí)成本更低。圖五顯示的數據表明通過(guò)StageTips 在高堿性條件下的分餾樣品處理，蛋白質(zhì)檢出量增加了50%，同時(shí)蛋白質(zhì)覆蓋率提高了10%。

圖5: HeLa細胞系用 Empore C18 StageTips在高堿性條件下進(jìn)行分餾處理可大大增加蛋白質(zhì)和多肽的檢出水平。

Empore還具有自身優(yōu)勢，其中可供選擇的功能顆粒和應用如下表所示。

【附帶說(shuō)明：】Empore原本由3M公司生產(chǎn)。2019年，萊伯泰科公司從3M公司收購了Empore的生產(chǎn)線(xiàn)，由旗下CDS公司全面掌握生產(chǎn)工藝并生產(chǎn)和銷(xiāo)售。許多將Empore作為關(guān)鍵材料的高科技產(chǎn)品得以繼續生產(chǎn)。